至今为止，还没有相关的实验室检查指标和影像学检查指标可以用于孤独症的诊断。孤独症的诊断依然主要基于儿童的发展及行为特征，详细的病史采集，和全面的神经精神检查评估。
通常情况下，医生会先了解患儿的生长发育情况，详细采集患儿及其亲属的病史。然后通过心理评估（多种孤独症相关量表），判断是否需要将儿童转介到专业机构进一步确诊。在完成早期筛查后，医生会根据患儿临床表现，有针对性地选择实验室检查，以进一步辅助诊断。
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孤独症的诊断与鉴别诊断比较复杂，依赖于医生的专业判断，因此一旦怀疑有相关表现，应尽快送医以明确诊断。
Asperger综合征以社会交往障碍和兴趣、活动局限，刻板和重复为主要临床表现，患儿言语和智能发育正常或基本正常。和孤独症患儿相比，Asperger综合征患儿突出表现为社交技能的缺乏，言语交流常常围绕其感兴趣的话题，并过度书面化，患儿对某些学科或知识可能有强烈兴趣，其动作笨拙、运动技能发育落后。DSM-5已将Asperger综合征纳入到孤独谱系障碍分类中。
其发病年龄超过3岁，或不同时具备孤独症临床表现中的3个核心症状，或只具备其中2个核心症状时，诊断为非典型孤独症。非典型孤独症可见于极重度智能低下的患儿、智商正常或接近正常的患儿，也可见于儿童孤独症患儿到学龄期时部分症状改善或消失，不再完全符合儿童孤独症诊断者。
Rett综合征是由MECP2基因突变所致，几乎仅见于女孩，患儿早期发育正常，大约6~24个月时起病，表现出言语、智能、交往能力等的全面显著倒退，和手运动功能丧失等神经系统症状。
以下几点对鉴别诊断具有重要作用：患儿无主动性交往，对他人呼唤等无反应；手部刻板动作，这是该障碍的特征性表现，可表现为“洗手”、“搓手”等刻板动作；随着病情发展，患儿手部抓握功能逐渐丧失，常伴有过度换气、躯干共济运动失调等。
又称Heller综合征、婴儿痴呆。患儿2岁以前发育完全正常，起病后已有技能迅速丧失，并出现和儿童孤独症相似的交往、交流障碍及刻板、重复的动作行为。该障碍与正常发育一段时期后才起病的孤独症较难鉴别。主要鉴别点在于Heller综合征患儿起病后所有已有的技能全面倒退和丧失，难以恢复。
该障碍主要表现为言语理解或表达能力显著低于应有水平。患儿非言语交流无明显障碍，社会交往良好，患儿无兴趣狭窄和刻板重复的行为方式。
患儿具有孤独症谱系障碍当中的社交交流障碍，但无兴趣狭窄和重复刻板的行为方式。
精神发育迟滞患儿的主要表现是智力低下和社会适应能力差，但仍然保留与其智能相当的交流能力。患儿没有孤独症特征性的社会交往和言语交流损害，同时其兴趣狭窄和刻板、重复行为也不如孤独症患儿突出。
还有儿童青少年精神分裂症、注意缺陷多动障碍、严重的学习障碍、选择性缄默症和强迫症等。
