布鲁氏菌病的临床表现不具有特异性，其诊断需要有布鲁氏菌实验室检查的证据。在血液、骨髓、脑脊液、伤口渗液、脓液、关节液中分离出布鲁氏菌可以协助确诊。医生诊断此病时，通常会经过以下几个步骤。
符合布鲁氏菌病的流行病学史及临床表现，即可做出疑似诊断。
疑似诊断基础上，同时虎红平板凝集试验（RBT）结果为阳性，或胶体金免疫层析试验（GICA）结果为阳性，或酶联免疫吸附试验（ELISA）结果为阳性，或布鲁氏菌培养物涂片革兰染色检出疑似布鲁氏菌，即可做出临床诊断。
符合疑似或临床诊断，同时满足实验室确诊检测结果中任一一项，可明确诊断本病。
符合布鲁菌病流行病学史，同时满足上述确定诊断的实验室检测中任一项，而没有临床表现者，为隐性感染。
本病应与其他可导致长期发热的疾病进行鉴别，特别是同时伴有多汗、关节痛、肝脾肿大的疾病，如结核、伤寒、淋巴瘤、结缔组织病等。详细的辅助检查将有助于疾病鉴别。
