医生首先会询问病史，以及对疼痛部位或肿块进行检查，然后，通过影像学检查来评估病灶，帮助确定可疑区域是否可能是癌症，确定肿瘤的范围和是否扩散。
如果影像学检查的结果指出患儿有极大患有尤文肉瘤的可能，医生会进行病理检查来进一步确认是否为尤文肉瘤。由于尤文肉瘤具有典型的染色体变异的遗传学特征，因此，特异性染色体变异分子诊断是尤文肉瘤的重要诊断依据。
此外，医生也会进行脏器功能及常规检查，以全面了解患儿的总体健康状况，来评估患儿的身体负荷，以寻找治疗中可能会出现的问题或不良反应。
最后，根据肿瘤所在的部位，医生会进行针对性的检查。比如：对于出现头部肿瘤的患儿，医生会对患儿进行腰椎穿刺，对脑脊液取样进行检查；对于出现血细胞改变的患儿，怀疑出现骨髓转移的情况下，医生往往会对患儿进行骨髓穿刺，对骨髓取样进行活检。
亚急性骨髓炎、骨嗜酸性肉芽肿和巨细胞瘤、骨肉瘤、骨原发性淋巴瘤、骨未分化高级别多形性肉瘤、急性白血病及其它非骨肿瘤的转移瘤，以上这些疾病因为影像学检查结果都与尤文肉瘤较为相似，容易误判。可以通过病理活检来区分。
