真菌感染可根据感染部位采集不同的标本，如果是头癣、甲真菌病及各种体癣、股癣等应采集病变部位的毛发、甲屑、皮屑等，如果是深部真菌感染则应根据病变部位采集脓汁、血液、脑脊液、分泌物、排泄物等作为标本。采集标本量要充足，深部真菌感染标本应严格无菌操作，避免污染，标本采集后做好标记及时送实验室检查，具体项目如下。
甲屑、毛发、皮屑等致密而不透明的标本，先用10%KOH微加热处理，标本软化和透明后加盖玻片不染色直接镜检。如观察到菌丝或孢子可初步诊断为真菌感染。深部感染标本，若疑是白假丝酵母菌感染，标本为痰、脓汁等分泌物时可直接涂片，标本为脑脊液、体腔液时需离心取沉渣涂片，革兰染色后镜检，镜下见到孢子、假菌丝可初步诊断。若疑是新生隐球菌感染，可用墨汁负染色后观察，见有肥厚荚膜的酵母型菌体可做出诊断。
若要提高检出率，并确定病原体种类可将标本接种至人工培养基上，进行分离培养。必要时还可选用其他特殊培养基如科玛嘉显色培养基进行鉴定。亦可作生化反应、毒素检测、分子生物学试验等进行鉴定。
通过检测真菌抗原、真菌代谢产物及抗真菌抗体等辅助诊断深部真菌感染，具有简便、快速、特异性和敏感性均较高的特点。如应用乳胶凝聚试验检测脑脊液中的新生隐球菌荚膜聚糖抗原，应用ELISA方法检测血清中曲霉的半乳甘露聚糖抗原，应用荧光抗体染色法对标本中的真菌抗原进行鉴定和定位等。
用于深部真菌感染的特异性鉴定，包括PCR相关技术、核酸杂交技术、DNA特异序列分析等。这些方法的应用不仅有助于深部真菌病早期诊断，也能及早确定真菌类型，指导临床治疗。
深部真菌感染的组织病理学检查在临床诊断上较为重要。临床通过手术、内镜等方式获取病理标本，经传统HE染色、PAS染色、嗜银染色等特殊染色或免疫组织化学技术进行检查。不仅可观察深部真菌病的组织病理反应，还可清晰观察到真菌的菌丝、孢子等，对诊断有重要意义。免疫组化技术可对临床常见各种条件致病性真菌感染做出特异性诊断。
怀疑有肺、脑、消化道真菌感染者，可行X线、CT等影像学检查观察器官的改变，有助于疾病诊断。
