可从溃疡边缘深部或基底部取材，先用生理盐水洗净患部，取其渗出物。如为淋巴结穿刺取材，应从健康皮肤处进针，以免形成瘘管，涂片时应从玻片的一端推向另一端，以保持细菌的特征形态。
涂片固定后可用Gram，Wright，Giemsa或Pappenheim Saathof染色，约50%可查见长约1～2cm末端钝圆的二极染色的短小杆菌，Gram染色阴性，单个或沿黏液丝方向呈团状或平行排列小群聚集，溃疡处常有与Ducrey嗜血杆菌相似的短小杆菌污染，但污染菌无“鱼群样”特征。
有核酸杂交技术和核酸扩增技术等，后者又分为PCR和LCR，32P标记的DNA探针已用于鉴定培养中的杜克雷嗜血杆菌，用PCR技术检测生殖器溃疡中的杜克雷嗜血杆菌对本病的诊断有一定价值，但也存在不少问题。
可从横痃或溃疡损害处取材，常用培养基为淋球菌胎牛血清培养基，Mueller-Hinton巧克力培养基等，2h内接种，置于5%～10%二氧化碳和饱和湿度环境中，于33℃～34℃至少培养48小时，杜克雷嗜血杆菌的菌落直径为2mm，呈光滑的半球形，黏性极强。
对已分离出的杜克雷嗜血杆菌，应进行生化试验进行鉴定，有氧化酶试验和硝酸盐还原试验等。
间接免疫荧光试验以与杜克雷嗜血杆菌外膜成分起反应的单克隆抗体检测生殖器溃疡分泌物涂片，酶免疫试验在培养阳性的本病患者中检出率为93%，可用于大规模人群的筛选检查。
显示3个层带，典型者有诊断意义。
呈重度急性炎症反应，有中性粒细胞浸润及坏死。
