可观察十二指肠黏膜的情况，还可在胃镜下取活组织做病理学检查和Hp感染检测，是诊断十二指肠溃疡的最准确的方法，也是评估治疗效果的主要方法。
对合并心脑血管疾病或因其他原因而无法接受内镜（胃镜）检查的患者可进行X线钡餐检查，通过十二指肠溃疡的特征表现（十二指肠龛影或局部痉挛、激惹及球部变形）也可进行诊断。
幽门螺旋杆菌检测可发现是否存在幽门螺旋杆菌感染，有助于明确病因，及指导后续治疗。但是不能作为诊断十二指肠溃疡的方法。
幽门螺旋杆菌检测有多种方式：取胃黏膜做幽门螺杆菌检测、13C或14C尿素呼气试验、血清抗体测定、粪便中找幽门螺杆菌抗原等，以第一种和第二种最为准确。
十二指肠溃疡患者常有胃酸分泌偏高，但处于正常胃酸值范围内也可以发生十二指肠溃疡, 无特异性诊断意义，并且操作复杂，故不作为常规检查。
大便隐血试验可以了解溃疡有无合并出血。
