培养阳性，并经生化鉴定为假单胞菌可以确诊。可在选择培养基上并产生绿脓色素的即可鉴定为铜绿假单胞菌。若无色素或在鉴别培养基上不发酵乳糖或葡萄糖的革兰阴性杆菌，可行以下方法进一步鉴别。

　　1.色素鉴定 可将细菌接种于绿脓菌素测定培养基(King A、B)斜面培养基，37℃ 24h或置室温观察5天。细菌在King A斜面上产生绿脓色素呈深绿色，液体培养基接触空气处绿色明显。若色素不明显或混杂其他色素，可加氯仿于斜面，置室温观察1～24h，如仍不明显，可在氯仿液中滴加稀盐酸，绿脓色素在酸液层呈红色。铜绿假单胞菌在King A斜面培养基上也可产生红脓毒素呈红紫色，但较少见。铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌在King B斜面培养基上产生绿脓荧光色素呈现黄绿色荧光。铜绿假单胞菌在含蛋白胨培养基中生长时常有黑脓毒素产生。嗜麦芽窄食单胞菌也有黑脓毒素产生。

　　2.与其他假单胞菌鉴定 铜绿假单胞菌氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖、木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖。液化明胶、可分解尿素，还原硝酸盐为亚硝酸盐并产生氮气，吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性。绿脓杆菌败血症患者尿中出现铜绿色蛋白尿，将患者尿液调成酸性、碱性和中性，置于暗室分别用紫外线照射，如有铜绿蛋白尿则发生淡绿色荧光。