取皮肤溃疡渗出液或淋巴结穿刺液，采用暗视野显微镜、镀银染色、吉姆萨染色或直接免疫荧光法可查到梅毒螺旋体，但检出率较低，适合于硬下疳或扁平湿疣患者。
属于梅毒过筛试验。若结果为阳性，一定需要确诊试验来证实，才能诊断梅毒。因为少数病毒性肝炎、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、妊娠及老年人等可出现假阳性，部分梅毒感染者，如并发HIV感染的患者，也可能出现假阴性。
此试验滴度的变化，还能作为疗效观察、复发或再感染的指征。
属于梅毒确诊试验。梅毒螺旋体侵入人体后，在血清中可出现梅毒螺旋体抗体，并终生存在，所以如果特异性梅毒螺旋体抗体阳性，意味着患者现在体内感染梅毒，可能需要治疗，或者患者过去感染过梅毒已经治愈。
极少数存在自身免疫性疾病、恶性肿瘤等问题的患者，血清检测中会出现假阳性表现，但后续复查，结果会变成阴性。
一期、二期、三期梅毒和潜伏梅毒患者均应行HIV检查。在HIV高发地区，若首次HIV检查阴性，应3个月后再次行HIV检查。
主要用于神经梅毒的诊断，包括脑脊液白细胞计数、蛋白定量、荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）和（或）性病研究实验室试验（VDRL）、聚合酶链式反应（PCR）和胶体金试验。
脑脊液白细胞计数和总蛋白量的增加，属非特异性变化，白细胞≥ 5×106/L，蛋白量＞ 0.5g/L，且无引起异常的其他原因；脑脊液VDRL和（或）FTA-ABS试验阳性，是神经梅毒的可靠诊断依据。
如果没有条件进行脑脊液VDRL和（或）FTA-ABS试验，可以用梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）、快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）或甲苯胺红不加热血清学试验（TRUST）替代。
X线摄片、心脏彩超、CT和磁共振成像（MRI）检查分别用于骨关节梅毒、心血管梅毒和神经梅毒的辅助诊断。
